Разработка иммуноанализов для определения С-реактивного белка с использованием нанозимов берлинской лазури
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук, Пермский край
Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024
Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине
Аннотация
Научная проблема, на решение которой направлен проект
Разработка технологических подходов к конструированию колориметрических иммуноанализов с использованием диагностических реагентов на основе нанозимов берлинской лазури. Нанозимами называют искусственно синтезированные наноматериалы, которые способны имитировать каталитическую активность ферментов. В частности, нанозимы берлинской лазури являются миметиками фермента пероксидазы хрена. Данный фермент наиболее часто используется в качестве цветной метки в тест-системах, например, в иммуноферментном анализе. Нанозимы берлинской лазури представляют большую привлекательность как альтернатива пероксидазе хрена ввиду простоты и низкой стоимости их синтеза, стабильности и высокой каталитической активности.
Однако на сегодняшний день для реального практического применения нанозимов берлинской лазури в конструировании коммерческих тест-систем недостаточно исследований, в которых были бы описаны примеры их применения для определения конкретных мишеней.
Решение описанной проблемы
Данную проблему можно решить путем проведения исследований, направленных на изучение применимости нанозимов берлинской лазури для определения конкретных мишеней. Мы планируем синтезировать диагностические реагенты на основе нанозимов берлинской лазури и разработать на их основе колориметрические иммуноанализы в двух форматах: иммуноанализ в лунках планшета (аналог иммуноферментного анализа) и иммуноанализ для экспресс-диагностики - иммунофильтрационный анализ с использованием нанозимов берлинской лазури. В качестве мишени будет выступать С-реактивный белок. Данный белок является одним из общепринятых маркеров воспаления и традиционной модельной мишенью для конструирования иммуноанализов. В ходе реализации проекта будут синтезированы подобраны оптимальные условия процедуры разработанных анализов, проведена оценка основных аналитических характеристик (аналитическая специфичность, воспроизводимость, точность), выявлены технологические трудности, с которыми могут столкнуться разработчики при конструировании подобных тест-систем.
Преимущества создания метода диагностики в формате, подобном иммуноферментному анализу: высокая аналитическая чувствительность и специфичность, высокий уровень воспроизводимости и точности ввиду автоматизации процедуры, наличие сертифицированного для использования в медицинских целях оборудования .
Преимуществами анализа, создаваемого в формате иммунофильтрации, являются: простота исполнения, высокая скорость получения результата, отсутствие хук-эффекта (в сравнении с более традиционным методом экспресс диагностики -иммунохроматографией), экономичность, отсутствие необходимости специализированного оборудования и высококвалифицированного персонала.
Следует отметить, что применение нанозимов берлинской лазури в качестве диагностических реагентов позволит использовать следующие их преимущества: 1) Дешевизна; 2) Высокая стабильность; 3) Высокая каталитическая активность; 4) Воспроизводимость синтеза; 5) Безопасность для человека, окружающей среды и простота утилизации.
Все вышеперечисленное позволит оценить возможности применения наночастиц берлинской лазури в качестве альтернативы ферментным диагностикумам как для традиционных лабораторных методов, так и для экспресс-диагностики (“point-of care” диагностика).
Что конкретно будет сделано в ходе реализации проекта:
Будут определены оптимальные условия получения диагностических реагентов на основе наночастиц берлинской лазури, а именно процесс функционализации их поверхности моноклональными антителами против С-реактивного белка;
Будет проведена оценка воспроизводимости синтеза, масштабируемости и стабильности при хранении полученных диагностических реагентов;
На основе полученных реагентов будут сконструированы колориметрический иммуноанализ в лунках планшета и иммунофильтрационный анализ для определения С-реактивного белка;
Для каждой тест-системы будет оптимизирована процедура анализа и проведена оценка основных аналитических характеристик (аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность).
Новизна
Новизна представляемого исследования обуславливается тем, что в работе будут использованы наночастицы берлинской лазури, синтезированные методом отличающегося от традиционного. Предлагаемый метод синтеза заключается в восстановлении смеси солей трехвалентного железа при помощи перекиси водорода. В исследованиях научной группы Аркадия Карякина и в наших предыдущих исследованиях, показано, что данный способ позволяет получать нанозимы с более высокой каталитической активностью. Высокоэффективные нанозимы на основе берлинской лазури еще не были применены в конструировании колориметрических иммуноанализов.
Ожидаемые результаты
1) Будут получены диагностические реагенты на основе нанозимов берлинской лазури, функционализированных моноклональными антителами против С-реактивного белка:
а) будет оптимизирован процесс модификации поверхности нанозимов берлинской лазури молекулами белка (будут использованы желатин А и бычий сывороточный альбумин);
б) будет оптимизирован процесс функционализации нанозимов берлинской лазури моноклональными антитела против С-реактивного белка;
в) будут выявлены условия масштабирования синтеза конъюгатов наночастиц берлинской лазури с моноклональными антителами против С-реактивного белка и его воспроизводимость;
г) будут оптимизированы условия хранения полученных диагностических реагентов.
2) На основе полученных диагностических реагентов будут сконструированы колориметрические иммуноанализы для определения С-реактивного белка в двух форматах - иммуноанализ в лунках планшета и иммунофильтрационный анализ:
а) будут подобраны оптимальные условия их процедуры;
б )будут оценены их основные аналитические характеристики (аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность).
Соответствие результатов мировому уровню:
Соответствие результатов мировому уровню определяется свойствами нанозимов. Сложность структуры и состава нанозимов, в том числе миметиков пероксидазы хрена, определяет повышенный интерес научного сообщества к углубленному изучению их активных центров, что помогло лучше понять механизмы получения таких реагентов. Все это привело к созданию нанозимов (одноатомные нанозимы, нанозимы на основе металл-органических каркасных структур, нанозимы на основе наночастиц берлинской лазури и т.д.) с повышенными в сравнении с пероксидазой хрена каталитической активностью и специфичностью по отношению к субстрату [Jin, 2022; Shen, 2022; Yan, 2021; ]. Например, в работе [Xi, 2021] описаны нанозимы на основе никель-платиновых наночастиц с пероксидазоподобной активностью, превышающую каталитическую активность пероксидазы хрена в тысячи раз. При помощью разработанных нанозимов удалось определить онкоэмбриональный антиген с нижним пределом детекции 1.1 пг/мл, что в сотни раз ниже традиционного иммуноферментного анализа [Xi, 2021].
Вышеперечисленное позволяет успешно создавать анализы для разнообразных мишеней. На основе миметиков пероксидазы хрена конструируются тест-системы для детекции ионов тяжелых металлов [Tseng, 2012; Lien, 2014; Serebrennikova, 2021] антибиотиков [Zhao, 2017], ДНК [Chau, 2016], глюкозы [Jv, 2010], простатспецифического антигена [Kim, 2017], бактерий [Panferov, 2021], вируса гриппа [Ahmed, 2016] и поверхностного антигена вируса гепатита и т.д. [Huang, 2019]. Также известно, что нанозимы берлинской лазури использовались в исследованиях, посвященных созданию методов определения глутатиона [Ma, 2019], глюкозы Zhang, 2014], человеческого сывороточного альбумина [Farka, 2018], гликохолевой кислоты [He, 2020].
Необходимо отметить перспективность применения нанозимов не только в области создания аналитических методов, но и в биомедицине и очистке окружающей среды от загрязнений.
Возможность практического использования результатов:
Полученные данные об оптимальных условия процедуры разрабатываемых анализов, их чувствительности, воспроизводимости, точности позволят оценить перспективы их трансляции в практику, выявить технологические сложности конструирования таких анализов, которые нужно усовершенствовать, и сформулировать предположения о способах такого совершенствования.
Следует отметить, что полученные результаты могут быть использованы для создания усовершенствованных тест-систем для одновременного определения нескольких маркеров воспаления (прокальцитонин, IL-6 и т.д.) и аналогичных тест-систем для определения других биологических маркеров.
Таким образом, данные, полученные в ходе реализации представляемого исследования, позволят расширить теоретическую базу, необходимую для успешного практического внедрения нанозимов берлинской лазури.
