ЯМР-релаксометрия в количественной иммунодиагностике онкологических заболевании с использованием функционализированных магнитных нанокомпозитов
Конкурс №18 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-602 - Физические методы медицинской диагностики. Томография
Аннотация
Разработка методов ранней диагностики социально значимых заболеваний и особо опасных инфекций является одним из приоритетных направлений современной медицинской науки. Не меньшее значение имеет создание систем, способных быстро, достоверно, с высокой чувствительностью обнаруживать, и идентифицировать различные биомишени и контролировать факторы, наличие или отсутствие которых, в том числе в количественном выражении, свидетельствует о состоянии окружающей среды, уровне эпидемических угроз для человека и с/х животных, как в обычной жизни, так и в условиях ЧС, безопасности биотехнологических процессов, качестве фармпрепаратов и пищевых продуктов и т.д. По существу, технологический прогресс в современном обществе, обеспечивая развитие всех отраслей промышленного производства, вместе с тем диктует необходимость создания не менее технологичных и высоко эффективных средств защиты от неизбежных отрицательных последствий, сопутствующих любому прогрессу.
В настоящем проекте предлагается разработка новых физических методов определения биологических маркеров в жидких средах. Основу проекта составляет применение функционализированных магнитных наночастиц и использование ядерной магнитной резонансной релаксометрии (ЯМР-релаксометрии), основанной на измерении времени поперечной релаксации Т2 ядерных спинов протонов жидкости. Время релаксации очень чувствительно к процессам, происходящим в результате образования специфических комплексов магнитных наночастиц с соответствующими биомишенями. Вследствие высокой чувствительности резонансной методики диагностически значимый сигнал фиксируется даже при минимальном изменении числа частиц, участвующих в процессе специфического комплексообразования. Последнее количественно зависит от концентрации определяемого лиганда, а измерение ЯМР-релаксометрией времени Т2, с участием магнитных частиц в процедуре детекции, может быть использовано как мера количества анализируемого вещества в образце. Высокая аффинность биологически активных соединений (стрептавидин, антитела), использованных для функционализации частиц, обеспечивает эффективность процессов связывания частиц с мишенью. Надежность функционализации подтверждается предыдущим опытом авторского коллектива (патенты РФ №2089912 от 10.09.1997; №2314827 от 20.01.2008; №2543631 от 27.01.2015 и № 2405655 от 10.12.2010). Вместе эти обстоятельства способны обеспечить распознавание молекул в анализируемом образце, объем которого может не превышать 5-10 микролитров.
Специфичность диагностики (аналитики), определяющая отсутствие как ложнопозитивных, так и ложнонегативных результатов, обеспечивается использованием аффинных соединений для функционализации наночастиц. При решении задачи анализа антител – это белковые антигены, в варианте применения биотинилированных зондов в системе, направленной на анализ белков и/или нуклеиновых кислот – это стрептавидин. При этом аффинные соединения ковалентно связаны с поверхностью наночастиц, а таргетные молекулы (антитела или биотинилированный лиганд) находятся в анализируемом образце на твердой фазе или во взвешенном состоянии в объеме анализируемого образца. Новым при решении указанной задачи будет использование синтезированных нами уникальных гибридных наноматериалов с высокой намагниченностью на основе нанокомпозитов 3d-металлов (Fe) инкапсулированных в углеродную оболочку (Fe@C) как платформы и поверхности, на которой могут быть сконструированы адресные биосистемы с новыми физико-химическими и биологическими свойствами. Диагностические возможности наносистем, снабженных аффинными биомолекулами, будут проверены экспериментально физическими методами и изучены на биомоделях, в которых будет обеспечена специфичность взаимодействия элементов системы анализа и мишеней в исследуемых образцах. Предлагаемая в проекте методология обладает не только высокой практической значимостью и конкурентными преимуществами, но и существенным уровнем универсальности. Об этом свидетельствует широкий спектр диагностически значимых маркеров, системы определения которых были успешно сконструированы авторским коллективом в форматах неинструментально аранжированного тестирования с использованием частиц коллоидного углерода: антитела к ВИЧ, онкофетальные белки, стрептококки и антитела к ним, токсины (ботулинический, столбнячный), возбудители псевдотуберкулеза и сифилиса и др. Конкретным модельным объектом в предлагаемом проекте будет простат специфический антиген (ПСА) как маркер рака предстательной железы. Предполагается разработка форматной аранжировки системы формирования диагностического комплекса, специфично связанного с металлуглеродными нанокомпозитами опухолевого маркера с использованием антител к ПСА и детекция его с помощью сконструированного ЯМР-релаксометра. Чувствительность определения позволит осуществлять диагностику на ранних стадиях развития заболевания, когда терапевтическое вмешательство может в большей степени приводить к позитивному исходу. Результаты реализации предлагаемого проекта, очевидно, найдут применение (в части медицинской диагностики) одинаково эффективно в диагностике не только онкологических, но и инфекционных заболеваний, оценке патологических и нормальных физиологических состояний человека.
Таким образом, актуальность и масштабность настоящего проекта обусловлена как появлением возможности с высокой эффективностью детектировать большое разнообразие биообъектов, так и высокой социальной значимостью задач, связанных с диагностикой различного вида заболеваний на ранних стадиях. Кроме того, не вызывает сомнений очевидная потребность в разработки импортозамещающих диагностических недорогих мобильных аппаратурных средств и методик для отечественного рынка.
Ожидаемые результаты
Результатом выполнения предлагаемого нами проекта будут являться: 1. Разработка технологии производства стабильных нанокомпозитов на основе железа, капсулированного в углерод с размером в диапазоне 5-8 нм, включая углеродную оболочку с величиной удельной намагниченности не менее 100 emu/g. 2. Разработка методов химической модификации углеродной оболочки с целью создания определенных концевых групп для стабилизации и участия в ковалентном структурировании на поверхности наночастиц биологически активных (аффинных) макромолекул, способных к специфическому связыванию с соответствующими биомишенями. Предполагаемые пары: антитела-антигены, стрептавидин-биотинилированные зонды. 3. Разработка и изготовление пилотного проекта мобильного портативного ЯМР-релаксометра для диагностики биообъектов на твердой фазе. 4. Отработка методик детектирования мишеней, основанных на новом физическом подходе - ядерной магнитной релаксометрии с использованием уникальных стабильных магнитных наночастиц с высокой намагниченностью и релаксивностью. Оптимизация существующей магнитной и регистрирующей системы с целью увеличения порога чувствительности метода при обнаружении мишеней. 5. Выбор базовой биологической модели (рак предстательной железы) и отработка методов контроля и подготовки реагентов для неё. 6. Разработка технологии функционализации поверхности модифицированного нанокомпозита на основе Fe@C с учетом выбранной биологической модели. 7. Оптимизация процедур анализа с целью повышения чувствительности и селективности метода при обнаружении биомолекул. 8. Верификация метода на основе конструирования конкретных клинически востребованных систем анализа оптимальных в части форматной аранжировки из числа сконструированных по результатам первичных исследований. 9. Проведение сравнительного анализа полученных данных в методе ЯМР-релаксометрии с традиционными методами диагностического тестирования.
Итоговым результатом выполнения проекта будет разработка высокочувствительного метода идентификации и количественной оценки биологических объектов на примере определения простат специфического антигена в качестве маркера рака предстательной железы. Основу метода составит использование ЯМР-релаксометрии в сочетании с уникальными нанокомпозитами структуры «ядро-оболочка» на основе наночастиц железа, инкапсулированных в углеродную матрицу (или “Гигантские Фуллерены” со средним размером 5-8 нм). Будет сконструирован ряд новых диагностических систем для высоко эффективного количественного определения молекулярных маркеров. Авторские технологии функционализации углеродных наночастиц будут адаптированы к использованию углеродной поверхности предлагаемых магнитных нанокомпозитов.
Авторский коллектив при выполнении всего проекта планирует опубликовать в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях не менее 8 статей в изданиях. индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science) и «Скопус» (Scopus). Не менее 10 статей в русскоязычных изданиях, учитываемых РИНЦ. Представление результатов на конференциях разного уровня – не менее 4. Подготовить документацию и изготовить пилотный экспериментальный образец портативного ЯМР-релаксометра. Сконструировать и оформить в виде наборов апробированные тест-системы для реальной диагностики. Оформить заявки на получение не менее двух патентов - на способ функционализации наночастиц и на способ иммуноанализа на основе ЯМР-релаксометрии.
