Тест-системы для детекции антител к возбудителю коронавирусной инфекции с использованием диагностических реагентов на основе наноматериалов
Конкурс №65 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс).
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Ключевые словаиммунохроматография, иммунофильтрация, наночастицы, диагностика, нанозимы, иммуноферментный анализа
Код ГРНТИ 62.41.99
Статус Успешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Будут разработаны тест-системы, предназначенные для качественной и количественной детекции антител к возбудителю COVID-19, позволяющие как служить инструментом постановки диагноза, так и инструментом оценки напряженности поствакцинального иммунитета к вирусу. В настоящее время на рынке представлено множество тест-систем, которые решают обе эти задачи (прежде всего это иммунохроматографические и ИФА-тесты). В чем же состоят потенциальные преимущества и новизна предлагаемых нами тест-систем? В рамках реализации этого проекта мы предполагаем разработать экспресс-тесты на антитела к коронавирусу в формате иммунофильтрации с использованием в качестве метки углеродных наночастиц и наночастиц, обладающих пероксидазной активностью (нанозимов). Предлагаемые подходы предоставляют ряд преимуществ в сравнении с коммерческими аналогами:
1. Преимущества иммунофильтрации (ИФ) по сравнению с наиболее популярным форматом экспресс-тестов, иммунохроматографией [Ross, 2019], состоят в большей чувствительности, большей простоте создании мультиплексных полуколичественных тестов (что соответствует задаче исследования), а также отсутствию хук-эффекта (отсутствию сигнала при высоких концентрациях анализируемого вещества в образце) [Ross, 2020] ввиду наличия этапов промывки;
2. В качестве диагностического реагента будут использованы наноматериалы, обладающие рядом преимуществ по сравнению с традиционными регентами, а именно углеродные наночастицы и наночастицы берлинской лазури (нанозимы), конъюгированные с антивидовыми антителами против IgG человека.
Углеродные наночастицы позволяют осуществлять визуальную детекцию результатов анализа без использования приборов по наличию или отсутствию окрашивания в тестовой зоне (пример на рис.). Преимуществами углеродных наночастиц как меток в иммуноанализе, является их высокая стабильность при длительном хранении [Raev, 2015], а также более высокая чувствительность анализов на их основе (в сравнении с наиболее часто используемыми золотыми наночастицами) [Zhang, 2020].
Нанозимы из берлинской лазури помимо яркой окраски, позволяющей производить визуальную детекцию сигнала, предоставляют возможность усиливать сигнал путем добавления хромогенного субстрата. Подобный принцип широко используется в иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе. В экспресс-тестах, в частности иммунохроматографических, он является одним из наиболее перспективных подходов усиления сигнала [Panferov, 2021]. Преимуществом наночастиц из берлинской лазури является высочайшая каталитическая активность [Komkova, 2018], физико-химическая стабильность, а также дешевизна и масштабируемость производства [Xu, 2019, Komkova, 2021].
Тест-системы будут реализованы в варианте непрямого анализа, т.е. на твердой фазе будут сорбированы антигены SARS-CoV-2: RBD-фрагмент S-белка (S) и нуклеокапсидный белок (N). Антитела к нуклеокапсидному белку не появляются при вакцинации, но детектируются при заболевании [Claro, 2021, Narasimhan, 2021]. В то же время увеличение титра антител к S-белку происходит и после вакцинации, и вследствие инфицирования коронавирусной инфекцией. Возможность одновременной детекции большого числа аналитов позволяет детектировать одновременно IgG против двух (и более) антигенов SARS-CoV-2 в нескольких технических повторностях (несколько одинаковых точек на одной мембране), а также использовать несколько контрольных образцов. Помимо этого, мы планируем протестировать вариант анализа, содержащий внутренние калибровочные образцы, что позволит осуществлять полуколичественную оценку концентрации антител, необходимую для оценки сероконверсии или наличия защитного титра антител (ожидается, что в скором времени этот титр станет известен). Внутренняя калибровка будет реализована путем сорбции на поверхность мембраны различных концентраций антигена, визуальная оценка их окраски позволит сделать вывод о концентрации антител в образце, а не только об их наличии [Skuratovsky, 2018].
Мы не планируем осуществлять детекцию IgM против белков коронавируса, поскольку в ряде исследований было показано, что это не повышает диагностическую ценность теста [Mohit, 2021]. Диагностическая ценность IgM при оценки поствакцинального иммунитета на настоящий момент не ясна, поскольку нет точных значений защитных титров антител и четкой корреляции титров нейтрализующих антител с титрами IgG или IgM против определенных антигенов [Knies, 2021].
Иммунофильтрация является простым и быстрым типом анализа и используется, в частности, для экспресс-диагностики ВИЧ [WHO]. Процедура анализа следующая: на поверхность иммунофильтрационной ячейки наносят образец (около 100 мкл), затем промывают ее несколькими каплями буфера, после чего вносят детектирующий реагент (в нашем случае это конъюгат углеродных наночастиц или нанозимов с антивидовыми антителами), затем вносят субстратный раствор (при использовании нанозимов) или же сразу промывают. Время анализа обычно составляет 1-2 минуты. Использование простых дозирующих устройств (специальных флаконов, одноразовых шприцов и т.п.) позволяет проводить анализ непосредственно у кровати пациента. Более такого, такие тесты могут использоваться и для самодиагностики.
Ожидаемые результаты
Впервые будет разработана тест-система, позволяющая осуществлять полуколичественную детекцию антител к коронавирусу в формате point-of-care, т.е. непосредственно у кровати пациента. Формат анализа (иммунофильтрация) и использование диагностических реагентов на основе углеродных наночастиц и нанозимов берлинской лазури обеспечат высокую чувствительность (за счет высокой каталитической активности и интенсивной окраски наночастиц) и надежность (за счет наличия промывок) тест-системы.
