Разработка диагностических реагентов на основе наночастиц берлинской лазури для колориметрического анализа
Конкурс №49 - Конкурс 2020 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине
Аннотация
К заявке приложен PDF файл с текстом заявки, содержащий иллюстрации!!!
Научная проблема, на решение которой направлен проект.
Разработка новых реагентов для клинической лабораторной диагностики, которые превосходят существующие материалы. Более конкретно, данный проект направлен на разработку диагностических реагентов, которые могут послужить альтернативой ферментным конъюгатам, используемым в иммуноферментном анализе.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из ключевых методов современной клинической лабораторной диагностики и повсеместно используется в количественной детекции различных биомаркеров (антител, компонентов вирусов, токсинов, гормонов и т.д.) в физиологических жидкостях, прежде всего в сыворотке и плазме крови.
Диагностическим реагентом в иммуноферментном анализе являются конъюгаты ферментов и распознающих молекул, зачастую, моноклональных антител. Наиболее популярным ферментом, играющим роль метки в иммуноферментном анализе, является пероксидаза, получаемая из корней хрена (Armoracia rusticana).
Существует ряд недостатков пероксидазы хрена, которые ограничивают спектр ее применений: 1) Относительная дороговизна; 2) Необходимость выделения фермента из растительного сырья, трудоемкость технологии выделения и низкий выход; 3) Гетерогенность очищенного фермента; 4) Чувствительность ферментов к воздействию физико-химических факторов; 5) Деактивация в присутствии некоторых металлом, солей, консервантов.
Решение описанной проблемы
Для преодоления перечисленных недостатков пероксидазы хрена мы предлагаем использовать в качестве альтернативы этому ферменту наночастицы на основе пористого координационного полимера берлинской лазури (KFe[Fe(CN)6] или Fe[Fe(CN)6]), которые обладают высокой пероксидазной активностью, превосходящей таковою пероксидазы хрена. Они могут превращать в окрашенный продукт те же хромогенные субстраты. Таким образом на их основе могут быть разработаны диагностикумы для колориметрического (цветного, ИФА-подобного) анализа.
Основой синтеза наночастиц берлинской лазури с высокой каталитической активностью (нанозимов) является восстановление смеси FeCl3 и K3[Fe(CN)6] (соли трехвалентного железа) перекисью водорода, что отличается от традиционного подхода, который основан на смешивании FeCl3 и K4[Fe(CN)6] или FeCl2 и K3[Fe(CN)6] (соли двух и трехвалентного железа) и приводит к получению намного менее каталитически активных наночастиц.
Что конкретно будет сделано в ходе реализации проекта:
1)Будут исследованы факторы, влияющие на результативность синтеза наночастиц берлинской лазури (размеры наночастиц, выход синтеза), на основе полученных данных будет разработана технология синтеза нанозимов различного размера.
2)Будут разработана и оптимизирована технология синтеза диагностических реагентов на основе нанозимов. Поверхность наночастиц будет стабилизирована желатином, к которому ковалентно будут “пришиты” аффинные соединения, в частности стрептавидин и моноклональные антитела.
3)Будут разработаны тест-системы для детекции IgG человека и С-реактивного белка, при помощи которых будет произведена оценка функциональной активности разработанных диагностикумов в сравнении с ферментными диагностикумами. Будет исследована коллоидная и функциональная стабильность конъюгатов на основе нанозимов при хранении.
Преимущества нанозимов на основе берлинской лазури как метки в колориметрическом анализе
Преимущества наночастиц берлинской лазури:
1) Дешевизна; 2) Высокая стабильность; 3) Высокая каталитическая активность; 4) Воспроизводимость синтеза. 5) Безопасность для человека, окружающей среды и простота утилизации.
Преимущества желатина, как материала для покрытия наночастиц:
1) Высокая эффективность стабилизации наночастиц; 2) Дешевизна и доступность; 3) Биосовместимость.
Новизна:
Высокоэффективные нанозимы на основе берлинской лазури еще не были применены в качестве альтернативы пероксидазе хрена в ИФА, следовательно:
1) Впервые будет проведено систематическое исследование влияния различных факторов на размер и выход синтеза высокоэффективных нанозимов на основе берлинской лазури.
2) Впервые будут синтезированы диагностические реагенты для колориметрических анализов на основе высокоэффективных нанозимов берлинской лазури и желатина, а также разработаны тест-системы на их основе. Впервые будут произведены систематические исследования их стабильности (функциональной и структурной) при длительном хранении.
Ожидаемые результаты
По итогам реализации проекта:
1. Впервые будут получены результаты о влиянии различных физико-химических условий на синтез наночастиц берлинской лазури, обладающих высокой каталитической пероксидазоподобной активностью (нанозимов). На основании полученных данных будут разработаны протоколы синтеза наночастиц берлинской лазури с различным размером. Будет осуществлена оценка воспроизводимости, масштабируемости и эффективности разработанных подходов к синтезу наночастиц.
2. На основе синтезированных наночастиц берлинской лазури с высокой каталитической активностью впервые будут разработаны диагностические реагенты которые смогут выступить в качестве альтернативы традиционно используемым диагностикумам на основе пероксидазы хрена. Будет произведено сравнение эффективности диагностикумов на основе наночастиц берлинской лазури и пероксидазы хрена. Будет проведена оценка коллоидной и функциональной стабильности диагностических реагентов на основе наночастиц.
Соответствие результатов мировому уровню:
Все полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований, что подтверждается многочисленными разработками и публикациями последних лет, направленными на использование нанозимов в in vitro и in vivo диагностике, терапии и биотехнологии.
Возможность практического использования результатов:
Будет сделан вывод о возможности использовании диагностикумов на основе берлинской лазури для создания колориметрических (ИФА-подобных и иммунохроматографических) тест-систем. Полученные данные о воспроизводимости, масштабируемости синтеза диагностикумов на основе наночастиц, их стабильности при хранении и эффективности позволят оценить перспективы их трансляции в реальную клиническую практику, выявить технологические аспекты синтеза диагностикумов, которые нужно усовершенствовать, и сформулировать способы такого совершенствования.
Помимо этого, результаты исследования могут быть использованы в смежных областях, в которых используются наночастицы берлинской лазури, прежде всего это in vivo применения: УЗИ, МРТ, фототермальная, фотодинамическая терапия, выведение из организма радионуклидов.
