Исследование стабильности и функциональных свойств ДНК- и РНК-аптамеров, иммобилизованных на поверхности углеродных наночастиц, применимых в системах диагностики и таргетной терапии
Аннотация
Актуальность
ДНК- и РНК-аптамеры представляют собой олигонуклеотиды, выделяемые из большого пула случайных последовательностей и обладающие способностью к высоко специфическому взаимодействию с целевым агентом: клетками, биомолекулами, ионами и т.д. Благодаря своим исключительным свойствам они рассматриваются в качестве альтернативы моноклональным антителам в биотехнологии и биомедицине. Одним из основных ограничений практического использования аптамеров является их низкая устойчивость к воздействию клеточных и внеклеточных нуклеаз. Иммобилизация аптамеров является одним из наиболее многообещающих подходов к решению этой проблемы.
Углеродные наночастицы – перспективный материал-носитель биомолекул в области биотехнологии, диагностики, таргетной доставки лекарственных средств. Ключевыми свойствами углеродных наночастиц являются их доступность, физико-химическая стабильность, низкая токсичность, высокая интенсивность окрашивания. Функционализированные аффинными соединениями углеродные наночастицы широко используются для создания систем иммунодиагностики: иммунохроматографических и дот-аналитических.
В настоящее время имеется множество данных об аптамерах, иммобилизованных на наночастицах различной природы, главным образом золотых, их стабильности и свойствах. Однако углеродным наночастицам внимание практически не уделено. В связи с этим целью настоящего проекта является исследование стабильности и функциональных свойств РНК- и ДНК-аптамеров, иммобилизованных на поверхности углеродных наночастиц, пригодных для использования в системах специфического взаимодействия (молекулярная диагностика, высоко технологичная терапия).
Методы
В работе в качестве моделей будут использованы ДНК- и РНК-аптамеры, специфичные к иммуноглобулинам классов Е и G человека, перспективные для использования в иммунодиагностике.
Синтез конъюгатов углеродных наночастиц с аптамерами, основанный на биоспецифическом взаимодействии (реакции стрептавидин-биотин) и ковалентном взаимодействии (глутаральдегид-опосредованная пришивка за счет аминогрупп аптамера).
Исследование функциональной активности иммобилизованных аптамеров при помощи оригинального метода: твердофазного дот-иммуноанализа.
Мониторинг стабильности иммобилизованных аптамеров при длительном хранении в различных температурных условиях, а также изучение устойчивости к воздействию нуклеаз сыворотки крови в системе in vitro.
Разработка на основе синтезированных наноконъюгатов моделей диагностических систем, предназначенных для выявления IgE и IgG в сыворотке крови человека.
Результаты
Результатом проекта будет являться получение новых сравнительных данных об активности ДНК- и РНК-аптамеров, свободных и иммобилизованных на поверхности наночастиц коллоидного угля. Будут впервые исследованы различные способы иммобилизации аптамеров на углеродных наночастицах: ковалентный и основанный на использовании реакции стрептавидин-биотин. Будут получены приоритетные данные о стабильности иммобилизованных аптамеров при длительном хранении, а также об их устойчивости к воздействию нуклеаз сыворотки крови человека. Результаты исследований позволят сделать вывод о перспективности использования углеродных наночастиц в качестве носителей аптамеров в области иммунодиагностики, терапии опухолевых и аутоиммунных заболеваний.
