Сравнительная характеристика рекомбинантных Escherichia coli lux+, используемых для оценки фагоцитоза
Фагоцитоз бактерий – динамичный процесс, исход которого определяется функциональным состоянием фагоцитирующей клетки и микроорганизма. Существующие методики позволяют оценить действие бактерицидных компонентов сыворотки крови и фагоцитоз нейтрофилов с использованием рекомбинантных бактерий E. coli lux+ по ингибированию биолюминесценции [1, 2, 3, 4]. Однако показано, что использование сенсора Эколюм-8 не позволило провести биолюминесцентный анализ фагоцитарной активности, вероятно, вследствие иного происхождения и свойств его люциферазы (lux-гены Photorhabdus luminescence) [5]. С другой стороны, у Эколюм-8 наряду с другими биолюминесцентными тест-системами (Эколюм-5, Эколюм-6, Эколюм-9) отмечена примерно одинаковая чувствительность в отношении неорганических и органических веществ [1], что, возможно, связано с особенностями методологического подхода при оценке.
Целью работы явилось проведение сравнительной характеристики рекомбинантных штаммов E. coli lux+ (lux-оперон Vibrio fischeri – Эколюм-5) и E. coli lux+ (lux-оперон P. luminescence – Эколюм-8) по уровню биолюминесценции и выживаемости при фагоцитозе с разными опсонизирующими факторами.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы E. coli lux+ с lux-оперонами V. fischeri (Эколюм-5) и P. luminescence (Эколюм-8), созданные Даниловым с соавт. [1].
Нейтрофилы периферической крови выделяли из гепаринизованной венозной крови здоровых доноров центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 и 1,112 г/мл). Фагоцитарная система состояла из суспензии нейтрофилов в среде Хенкса (106 кл/мл), пула термоинактивированных (56оС, 30 мин) или интактных сывороток крови (10%) и регидратированного сенсора E. coli lux+ (106-108 кл/мл) (10%). Контрольные пробы содержали те же компоненты, но без нейтрофилов.
Индекс фагоцитарной активности (ИФА) оценивали по биолюминесценции сенсоров на планшетном люминометре Luminoscan Ascent (Финляндия) через 40 мин контакта с нейтрофилами и/или опсонинами, вычисляли по формуле: ИФА=(X1-X2)/X1×100%, где X1, X2 – интенсивность биолюминесценции контрольной и опытной пробы, соответственно [3]. Выживаемость E. coli lux+ определяли высевом на среду Эндо с ампициллином (50мкг/мл) через 40 мин контакта, количество выросших колоний (КОЕ/мл) подсчитывали через 24 ч. Индекс ингибирования роста (ИИР) рассчитывали по формуле: ИИР=(КОЕk-КОЕo)/КОЕk×100%, где КОЕk, КОЕo – число КОЕ/мл контрольной и опытной пробы, соответственно.
Результаты исследований
Установлено, что нейтрофилы проявляли более высокую фагоцитарную активность в отношении сенсора Эколюм-8 с пулом интактных сывороток по сравнению с пулом сывороток без комплемента, что подтверждалось уровнем выживаемости бактерий (ИИР) в данных системах (таблица). Поскольку оптимумы работы люциферазы данного штамма и фагоцитарных систем совпадают и составляют 37оС, влияние температуры на биолюминесценцию бактерий и ИФА отсутствовало.
В системе с сенсором Эколюм-5 активность нейтрофилов в целом была ниже, чем с Эколюм-8. Тем не менее, присутствие комплемента в сыворотке положительно влияло на фагоцитоз. Однако, более высокое значение ИИР Эколюм-5 с пулом термоинактивированных сывороток по сравнению с пулом интактных свидетельствовали об изменении способности бактерий образовывать колонии. Возможное объяснение этого связано с повышением чувствительности данного сенсора с увеличением температуры до 37оС, т.к. высокая активность люциферазы проявляется при 28-30оС. Кроме того, сложная структурная организация lux-оперона Эколюм-5 (наличие регуляторных генов, SOS-боксов) создает трудности в интерпретации изменения биолюминесценции при оценке фагоцитарных свойств нейтрофилов. Поэтому возможность применения сенсора Эколюм-5 для заявленных целей требует дальнейшего изучения. В то время как сенсор Эколюм-8 позволяет проводить оценку фагоцитоза in vitro по ингибированию биолюминесценции в физиологических условиях.
Таким образом, при проведении биолюминесцентной оценки фагоцитоза следует учитывать структурные особенности, температурные оптимумы люциферазных систем рекомбинантных штаммов E. coli lux+.
